Előkísérletek házi méh (Apis mellifera) genotipizálására és spermium mélyhűtésére

Absztrakt

A krajnai méh Kárpát-medencei állomány genetikai diverzitásának és tisztaságának felmérését kezdtük el genomikai alapon fejlesztett DNS markerek segítségével. A különböző családokban az anyák genotípusait STR markerek segítségével tudjuk meghatározni, és kiválasztani, mit érdemes hosszútávon ex-situ tárolni. A felolvasztott spermiumokkal méhanyák mesterségesen termékenyíthetők és visszaállíthatók, illetve irányított keresztezésekbe állíthatók az eltárolt vonalak. Ezért a herék spermiumainak kinyerésére és mélyhűtésére egy jól használható módszert kell kidolgoznunk. Kifejlesztettünk egy saját, sztereomikroszkópos preparálási módszert, az ivarsejteket a szeminális vezikulumból nyertük ki. A spermiumokat tartalmazó médiumot 2 percig 700g-vel centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a csapadékot meghatározott mennyiségre hígítottuk, majd 3:2 arányban kevertük össze a krioprotektív anyagokkal (CPA): DMSO25%+BSS+tojássárgája; DMSO10%+BSS+tojássárgája, DMSO25%+Harbo+tojássárgája, DMSO10%+Harbo+tojássárgája. Megállapítottuk, hogy a DMSO-s keverék nem toxikus a spermiumok számára. A 10μl-nyi CPA-val kevert spermiumot 80μl hígítót, 10μl CPA-t tartalmazó 0,25μl-es műszalmákba töltöttük. Tört jégen történő inkubáció után a minták egyik felét közvetlenül a folyékony nitrogént tartalmazó tartályba helyeztük, a másik felét pedig programozható fagyasztógéppel 3 °C/perc sebességgel, -40 °C-ig hűtöttük. A felolvasztást 38,5°C-os vízfürdőben végeztük, majd a mintákat 38,5oC-on inkubáltuk 10 percig, majd a motilitást fázis kontraszt mikroszkóppal újból megvizsgáltuk. A 10%-os töménységű DMSO-s oldattal kevert spermiumok kivétel nélkül elpusztultak a fagyasztás során, míg a 25%-os koncentrációjú DMSO-s oldattal kevert spermiumok 80%-a (amelyeket programozott lassú hűtéssel fagyasztottunk) túlélte a kezelést, de a felolvasztást követően gyengébb motilitást mutattak.